Comment Choisir Des Enzymes De Restriction

Comment Choisir Des Enzymes De Restriction

Les enzymes de restriction sont des enzymes qui coupent l'ADN à la fois d'une et double chaîne. Chaque enzyme de restriction a une séquence nucléotidique spécifique, appelée site de restriction, qui reconnaît et coupe. Les enzymes de restriction sont utilisées pour le séquençage de l'ADN, l'analyse mutationnelle et le clonage et l'amplification de l'ADN. Les scientifiques utilisent des enzymes de restriction pour insérer des gènes d'intérêt dans des vecteurs d'expression, des molécules d'ADN qui peuvent être répliquées séparément de l'ADN chromosomique. Le vecteur contenant le gène d'intérêt peut ensuite être introduit dans une souche bactérienne pour l'expression et la caractérisation des protéines.

Identifiez les sites d'enzymes de restriction dans votre vecteur en consultant une carte de restriction. La carte de restriction vous dira quelles enzymes vont couper votre vecteur et oĂą.

Choisissez une enzyme de restriction qui a également un site présent dans l'insert du gène, en observant la séquence de l'insert. Assurez-vous que le site de restriction est dans une position dans l'insertion qui est en dehors du gène d'intérêt, de sorte que vous ne perdez aucune partie du gène.

Assurez-vous qu'il n'y a aucun doublon du site de restriction dans votre insertion ou vecteur de gène. Cela provoquera de multiples coupures dans votre ADN et vous donnera des données trompeuses.

Essayez de choisir les enzymes de restriction qui coupent les extrémités cohésives, plutôt que les extrémités émoussées. Les extrémités collantes se produisent lorsque l'enzyme coupe l'ADN double brin en quinconce, laissant un seul brin en porte-à-faux qui facilite la fixation avec une coupe d'insertion de la manière opposée. Les extrémités obtuses se produisent lorsque l'ADN double brin est coupé d'une manière douce, et ceux-ci sont plus difficiles à joindre.

Choisissez une enzyme de restriction différente pour les deux extrémités de votre insert afin de vous assurer qu'il est inséré dans le vecteur dans la bonne orientation et que le vecteur ne se reconnecte pas.

Essayez de choisir deux enzymes de restriction qui fonctionnent bien dans le même système de tampon et de température. Si cela n'est pas possible, exécutez chaque digestion séparément.

Conseil

Certains programmes web ont été développés pour identifier rapidement les sites de restriction d'une séquence d'ADN. Un de ces programmes vient de New England Biolabs.

Tutoriel Vidéo: Biochimie: les acides nucléiques;Partie 7: enzymes de restrictions,carte de restriction.

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